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動態(tài)濁度法的建立及測定角膜真菌感染標本的初步研究
作者：劉宏偉，王香蘭，彭淑玲，周 毅
【摘要】 目的 建立動態(tài)濁度法，研究角膜真菌感染的檢測。方法 分別測定葡聚糖標準品、內(nèi)毒素標準品、真菌標準株(煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌)及細菌標準株(綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌)，測定19例臨床標本。
結(jié)果 葡聚糖的濃度時間曲線為雙曲線，時間反應(yīng)曲線顯示反應(yīng)速率較低。內(nèi)毒素的濃度時間曲線為直線，時間反應(yīng)曲線顯示反應(yīng)速率較高。三種真菌的濃度時間曲線和時間反應(yīng)曲線與葡聚糖的相似，革蘭陰性菌（綠膿桿菌）的濃度時間曲線和時間反應(yīng)曲線與內(nèi)毒素的相似，革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌）沒有反應(yīng)。臨床19例標本，根據(jù)其濃度時間曲線和時間反應(yīng)曲線的形態(tài)，11例確診為真菌感染，8例為革蘭陰性細菌曲線，為真菌和細菌的混合感染。
結(jié)論 動態(tài)濁度法可用于角膜真菌感染的檢測，但對細菌-真菌混合感染不能確診。
【Abstract】 Objective To establish the turbidimetric kinetic assay and study the measurement of fungus infection in corneal specimen.Methods Glucan， endotoxin， fungus(Aspergillus fumigatus，F(xiàn)usariun moniliforme and Fusariun solani) and bactiria(Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureaus) were measured. 19 clinic specimens were also measured.Results The concentration-time curve of glucan was hyperbola and its time-reaction curve had low reaction rate. The concentration-time curve of endotoxin was beeline and its time-reaction curve had high reaction rate. The concentration-time curve and time-reaction curve of 3 fungi were same as that of glucan. The concentration-time curve and time-reaction curve of G- bacterium(Pseudomonas aeruginosa) were as same as that of endotoxin. The G+ bacterium(Staphylococcus aureaus) had no reaction. According the concentration-time curve and time-reaction curve， 11 specimens were diagnosed fungi and 8 specimens were co-infection of fungi and bacteria.Conclusion Fungi infection in cornea could be diagnosed by turbidimetric kinetic method. Co-infection of fungi and bacteria could not be diagnosed by this method.
【關(guān)鍵詞】 動態(tài)濁度法；真菌；角膜；葡聚糖
【Key words】 turbidimetric kinetic method；fungus；cornea；glucan
角膜真菌感染的診斷較難，如不能及時治療，對患者造成損害，因此快速診斷非常必要。真菌的診斷一般采用鏡檢和培養(yǎng)的方法，鏡檢較快，但漏檢率較高，真菌培養(yǎng)的方法，檢出率較高，但時間較長。我們使用鱟試劑與真菌的葡聚糖反應(yīng)的原理，建立動態(tài)濁度法并對角膜標本進行真菌測定。
1 材料與方法
1.1 試劑 葡聚糖標準品(031222，規(guī)格：300μg/ml)，鱟試劑（批號040532，靈敏度：0.25Eu/ml）購自廈門鱟試劑廠，內(nèi)毒素標準品（批號2002-7）和檢測用水(批號2003-3)購自中國藥品生物制品檢定所。
1.2 儀器 細菌內(nèi)毒素測定儀、振蕩器，超聲波處理器、離心機。
1.3 葡聚糖和內(nèi)毒素的濃度-時間曲線
1.3.1 葡聚糖 將其倍比稀釋為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和 0.20μg/ml，取其200μl加入100μl鱟試劑，振蕩30s，放入細菌內(nèi)毒素測定儀測定，測定溫度為(37±1)℃。
1.3.2 內(nèi)毒素 將其10倍稀釋為50、5、0.5、0.05和0.005EU/ml，按上述方法測定。
1.4 細菌、真菌標準株的測定 細菌包括革蘭陰性菌(綠膿桿菌)和陽性菌(金黃色葡萄球菌)，真菌包括煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌。在培養(yǎng)基上取少量菌落，加入1ml檢測用水，超聲波處理30min，2000cpm，10min，取上清。用檢測用水將其按10倍稀釋，分別取200μl加入100μl鱟試劑，振蕩30s，細菌內(nèi)毒素測定儀測定。
1.5 標本的處理 角膜標本來自北京普仁醫(yī)院眼科，為臨床確診真菌性角膜炎后，進行角膜移植，將角膜標本用檢測用水沖洗后，在潔凈臺中將其剪碎，加入1ml檢測用水超聲波處理30min，2000cpm，10min，取上清備用。
1.6 標本的測定和結(jié)果的確定 共檢測臨床診斷真菌的感染的角膜標本19例，標本處理后，用檢測用水將其按10倍稀釋8個稀釋度，分別取200μl加入100μl鱟試劑，振蕩30s，放入細菌內(nèi)毒素測定儀測定。根據(jù)標本的濃度-時間曲線、時間反應(yīng)曲線和時間速率曲線確定。
1.7 細菌內(nèi)毒素測定儀的檢測指標 內(nèi)毒素或葡聚糖與鱟試劑中的B、C或G因子反應(yīng)，形成凝膠，記錄不同濃度的內(nèi)毒素或葡聚糖在反應(yīng)過程中不同時間的光密度值，確定OD值達到0.02的反應(yīng)時間為測定反應(yīng)時間，以反應(yīng)時間為縱坐標，以藥物濃度為橫坐標，做圖，成為濃度時間曲線。時間反應(yīng)曲線為某一濃度的內(nèi)毒素或葡聚糖在不同時間的OD值，以時間為橫坐標，以樣品的OD值為縱坐標，做圖。時間速率曲線為某一濃度的內(nèi)毒素或葡聚糖在不同時間的反應(yīng)速率，以時間為橫坐標，以樣品的反應(yīng)速率為縱坐標，做圖。
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