細菌內毒素檢查法常見問題與探討
摘要:
目的 總結歸納細菌內毒素檢查法中的常見問題。
方法 收集整理工作中發現的問題，查閱國內外有關文獻資料，對照分析應用情況并比較其差異。
結果與結論：從五個方面較為全面的總結了細菌內毒素檢查法所涉及到的問題，認為在應用方面還需要進一步完善、規范。
[關鍵詞：細菌內毒素檢查法；問題]
Discussion of common issues in the Bactaril Endutoxin Test, BET
ZHOU Su-Wen.（Pharmacology Laboratory, Hubei Institute of Drug Examination, Wuhan 430064）
ABSTRACT: OBJECTIVE to summarize and conclude the common problems in the bacterial endotoxins test. METHODS by collecting the practical problems in work and referring to the related articals and information, we compared and analyzed their differences. RESULTS and CONCLUSION the problems concerning the bacterial andotoxins test were comprehensively generalized in the review from five aspects and the conclusion showed that the application of the bacterial endotoxins test need to be further enhanced and standardized.
Key word: Bactaril Endutoxin Test； problems
細菌內毒素檢查法(Bactaril Endutoxin Test,BET )是近二十年來發展起來的用于檢測藥品及其中間品中內毒素污染的一種方法；作為家兔熱原檢查法的一種替代，已經十分成熟，美國藥典迄今已為八百余種藥品制定了該項檢查法，中國藥典自1990年版開始收載以來，每版藥典細菌內毒素檢查品種也逐步增多，2005年版已增加到204種，并且在增補本中將繼續增加收載數量，該方法相對家兔熱原檢查法而言，有勞動強度低、快捷、經濟、靈敏和易于標準化等優點，受到廣大藥品質檢人員高度關注。2005年版藥典在2000年版藥典基礎上在方法學、結構及細節上均進行了重大修訂，使其更加規范、合理。
由于該方法本身是一復雜的酶促反應過程，試驗步驟比較多，每個品種的限值制定和試驗過程中涉及到的標準品、鱟試劑、檢查用水及干擾因素等，均會給對實驗結果造成不同程度的影響，以下是筆者近年來在藥品檢驗過程中發現的較為常見的問題進行的匯總, 以期對實際工作具有參考價值。
1、標準及限值的制定
一個品種的標準及限值制定的妥當與否，直接決定了對藥品本身質量的評價要求，標準要求太高、限值過嚴，往往影響產品的合格率，太松則不能保證藥品質量，危及臨床用藥安全。為此，各國藥典均提出了基本的制定原則，除特殊情況需要說明外，一般注射劑均按人最大致熱閾值和人臨床每小時每公斤體重最大使用劑量的關系來確定，即L=K/M（通常靜脈給藥的K值為5Eu/kg，M為人每小時每公斤體重最大使用劑量），而大輸液(100-500ml) 的限值各國基本是一致的，無論是復方還是單方，均可按單位體積中所含內毒素的量來控制，（一般按 0.5Eu/ml）；看似簡單的問題，在執行中卻經常出現各種各樣的問題。常見問題舉例如下：
1．1 應以重量(mg)表示的錯用體積(ml)表示
注射用更昔洛韋鈉，按公式計算，其限值應為1.0 Eu/mg，但生產單位要求改為0.5Eu/ml，且未提供任何制定理由，也未說明稀釋方法。使檢驗人員無法操作。
1．2 不按人臨床用量計算，按熱原劑量計算
精氨酸阿斯匹林，若按人臨床用量計算其限值應為0.3Eu/mg，但檢查法制定中卻按熱原劑量計算為0.03Eu/mg，嚴格了10倍，因濃度較高，出現了干擾，給試驗帶來了麻煩。
1．3 隨意放寬標準
有的新藥研發單位對自己的產品沒有信心，或按規定的限值不能過關（檢驗不合格或有干擾），則將標準隨意放寬，如0.5Eu/ml，研發單位自行改為“稀釋6倍后，按0.5Eu/ml。。。。。。”，放寬了6倍，且未說明理由。
1．4 照搬錯誤的標準
一品種限值根據其臨床用量計算應為5Eu/mg，但已有暫行國家標準，限值為75Eu/mg，廠家則要求改為75Eu/mg，實際上第一個廠家所報標準沒有根據，但由于漏審或未經專業人員審查直接變成了國家標準，此類標準太松。無法控制質量。
1．5 相同品種具有不同的國家標準
在2004年全國大輸液抽樣檢驗的500批樣品中，細菌內毒素檢查和熱原檢查標準較為混亂，有的采用家兔熱原檢查法，有的則是細菌內毒素檢查法，且部分內毒素檢查法同一品種限值卻不一樣。例如：克林霉素磷酸酯注射液，有的標準限值規定為0.5 Eu/mg，有的則為0.6 Eu/mg 。
1．6 隨意修改，將正確的改為不正確
某一注射用藥品，某省所在進行方法學研究時，按臨床用量計算后將限值定為60Eu /mg；申報單位在資料匯總時改為：“取本品，加水5ml，再稀釋8倍，每瓶含內毒素的量不得過100 Eu”。（本品規格為：10mg/支，人用量5mg/次）。盡管修改后的標準較之修改前嚴格了，但對標準的修改沒有提供任何支持的實驗數據。此外，該標準尚存在三處明顯的錯誤，其一是沒有注明細菌內毒素檢查用水，而是僅僅描述為加水。其二是沒有規定具體的藥品規格，只是描述為“每瓶含”，忽視了每瓶可能帶來的規格問題。其三則是限度的規定盡可能不使用類似“不得過”的描述，目前更準確的描述多采用“應小于.....”
1．7 檢驗方法表述不清楚
紫杉醇注射液：“取本品，加細菌內毒素檢查用水至少稀釋40倍后，依法檢查（附錄2000年版 ⅪE），每ml中含內毒素的量應小于2.4Eu”；此類表述很容易引起理解上的錯誤，是原液中的限值為2.4Eu /ml，還是稀釋后每ml中應小于2.4Eu？無經驗的操作人員往往會認為是后者。此類問題，2002年全國藥理室主任會及05年版內毒素品種擴大會議已有統一意見，不提倡如此寫法，因不同廠家、不同工藝生產的同一品種樣品往往干擾程度不一致，稀釋倍數就不一定相同（特別是中草藥注射劑）。
1．8 在藥典標準中出現原料藥與制劑限值不一致
阿米卡星（制劑）0.33Eu/mg，原料2.2Eu/mg，前者是計算值，后者如何得來，不得而知。（已將后者勘誤糾正為0.33 Eu/mg）
1．9 用滅菌注射用水代替細菌內毒素檢查用水
某質量標準記述為：“取本品，加滅菌注射用水10ml溶解后，依法檢查．．．．．．”。此類標準往往是按說明書上臨床用法照搬而來的。
2、檢查方法及干擾試驗
2．1樣品檢查
在對樣品進行檢查時，由于研發單位對檢驗人員的專業技術培訓不夠，使得操作者對標準及操作中的基本概念區分不清，理解有誤。例如：
2．1．1 0.5ml/支裝量與靈敏度0.5Eu /ml的鱟試劑， 0.5Eu/ml與0.5EU/mg限值的概念不清。
2．1. 2 配制樣品溶液時，在理解限值（L）與鱟試劑靈敏度 ( λ ) 的關系問題上概念模糊，如：青霉素限值為0.01Eu/100u；有的用戶就認為一定要0.01Eu/ml靈敏度的鱟試劑；又如甲硝唑注射液，過去的標準限值0.35Eu/ml，就要求買0.35Eu/ml靈敏度的鱟試劑。
2．1. 3 不管品種性質是否適合將家兔熱原檢查法改為內毒素檢查法，從而導致了標準上的不統一和結果的不一致。如：中草藥注射劑，一些新生物制品，某些醫療器材等，它們造成的發熱可能不僅僅是內毒素，可能還有多糖核苷酸，高分子抗原或半抗原等非內毒素熱原，細菌內毒素檢查不能檢測出該類物質，一味地將這類產品改為BET，在臨床上可能就存在熱原反應的隱患
2．2 干擾試驗
在對某一品種建立細菌內毒素檢查法的過程中，干擾實驗是十分重要的環節，只有證實該品種不存在干擾或去除了干擾，才能用于日常的檢驗。干擾的類型主要表現為抑制干擾和增強干擾。很多實驗室的經驗表明絕大部分的干擾因素來自于樣品，如：不同來源的原料、生產工藝的改變，導致樣品的PH、樣品的成分、樣品的濃度等變化。因此，即使來自不同廠家的同一品種，其生產質量也不盡相同，所以應該要求每個生產廠家在報批時均應提供有關方法學的研究報告。
表現在方法學驗證及樣品最大無干擾濃度上的問題主要有：
2．2. 1 認為國內或國外已有生產的品種，方法學驗證就可以不做。造成大量的新藥標準－特別是仿制藥未做系統的干擾試驗。
2．2 . 2 認為一定要按最大有效稀釋倍數（Maximum valid dilution MVD）或最小有效濃度（Minimum valid concentration MVC）進行實驗。實際上，有的樣品濃度很高也不干擾鱟試劑與內毒素的反應，這種情況下，只要樣品內毒素含量合格，可以在MVD范圍之內，即小于MVD的倍數下進行試驗，如果一個樣品在小于MVD的情況下試驗時樣品陽性管有干擾，或樣品管為陽性，可再按MVD進行相對應的稀釋重新試驗.
3、與國外標準的差異
3．1.單次試驗鱟試劑的加樣
鱟試劑的規格分單次試驗瓶（STV）及多次試驗瓶(MTV)兩類。目前世界上除中國外其它國家STV的使用都是直接加0.2ml樣品溶液復溶試劑兼檢查。中國藥典對STV要求是先加0.1ml BET水復溶，再加0.1樣品溶液作檢查。
3．2.工作標準品的效價標定
內毒素工作標準品(CSE)的效價標定有兩種方法，一種是浮動效價標示法，另一種是固定效價標示法。浮動效價標示法對每批號CSE只標示它的含量（重量，如mg, ng等），當這批號CSE確定配那一批鱟試劑使用時，鱟試劑廠家才向用戶提供一份效價測定證書(Certificate of Analysis, CoA)，給出使用該批號鱟試劑測定的RSE/CSE比率以及該批號CSE的效價。固定效價標示法是以某一批（或數批）鱟試劑測定該批CSE的RSE/CSE比率，從而計算出該批CSE的效價。例如，某批鱟試劑對某批CSE的RSE／CSE比率是8Eu/ng，該批CSE的裝量是10 ng/支，則CSE的效價就是8Eu/ng×10ng/支＝80Eu/支，以此作為該批CSE的標示效價。目前歐美國家采用的是浮動效價標示法，我國采用的是固定效價標示法。以上兩種效價標示方法都有所長和不足，其應用背景也不盡相同。
嚴格說來，中國的工作標準品和美國的工作標準品在定義上不完全一致，中國藥典對內毒素工作標準品的定義是：系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價，用于實驗中鱟試劑靈敏度復核、干擾實驗和設置的各種陽性對照。美國內毒素工作標準品最初的使用是源于國家標準品的費用較高和對國家標準品的潛在消耗，建立工作品的主要目的是作為國家標準品的替代品，用于日常內毒素檢測工作的，由于美國實行鱟試劑批批檢制度，因此工作品不用于鱟試劑靈敏度的復核，主要是用于設置各種陽性對照（陽性對照和供試品陽性對照）和確證試劑、實驗材料和操作方法的可行性；FDA對工作品不進行控制，由生產廠家自行生產和管理。
在我國，現階段對鱟試劑的靈敏度沒有進行批批檢定，鱟試劑的出廠檢驗一直是由廠家自行按部頒標準進行；由于各鱟試劑廠家之間的生產條件、工藝技術水平還存在一定差異，很難保證每一批鱟試劑的靈敏度都符合標準，為此規定用戶在使用前用統一的工作品復核靈敏度；應該說，中國的工作標準品除了有“工作”的含義外，還有一定意義上的“監控”作用。基于此，就現階段來說，我們還無法評價國內外這種標定差異上的利與弊，期望今后能在不斷的實踐過程中，能找出更為有效的、合理的辦法。
3.3 對供試品溶液pH要求
中國藥典BET法對供試品溶液的pH值要求在6.0~8.0的范圍內。但實際上，有許多樣品溶液的pH值不在此范圍內也對BET不造成干擾，原因是鱟試劑本身有緩沖能力。事實上，應該這樣認為：一個供試品是否要調節pH值，應根據干擾試驗的結果來判斷。如果該供試品對BET有干擾，且干擾的原因是由pH值不適宜造成的，才有必要調節供試品的pH值。美國藥典BET法對供試品溶液pH的要求是：測定供試品溶液與鱟試劑溶液的等體積混合液的pH值，應在6.0~8.0范圍內。這意味著當供試品溶液的pH值的影響超出了鱟試劑的緩沖能力時，才需要去調節供試品的pH。
4、關于細菌內毒素檢查用水
2005版藥典規定凝膠法用細菌內毒素檢查用水內毒素的量應小于0.015Eu/ml ，對使用靈敏度為0.5Eu/ml的鱟試劑沒有多大問題，但如果用0.03Eu/ml的鱟試劑則可能存在問題。如果試驗結果為陽性，則應慎重考慮。
5 、其它
5、1不宜建立BET的品種
根據本實驗室經驗 ：
5.1.1中草藥注射劑，由于中藥成份復雜、干擾因素多、同一品種樣品往往干擾程度不一致，且陽性率偏高；如炎琥寧，復方丹參注射液、紅花注射液、紫杉醇注射液等。
5.1.2部分生物制劑及鈣鎂離子鰲合劑，酶抑制劑等
5.2需要處理的品種
5.2.1 不適宜的pH條件，如樣品的 pH值偏高或偏低，可用堿性或酸性緩沖液來調節至合適的pH值范圍，或采用高靈敏度鱟試劑進行相應稀釋后來解決。濃度較高的氨基酸品種及部分抗生素品種均可通過通過以上方法來解決干擾。
5.2.2 由于鱟試劑中促使凝膠形成的絲氨酸蛋白酶可以被多種化學物質變性失活（如醇、酚、抗癌藥物等），如果導致鱟試劑變化的藥物是蛋白酶類，可用70℃加熱10分鐘左右熱處理后再稀釋，或者使用超過濾的方法。
5.2.3 對鈣鎂離子有鰲合作用的品種，可使用含鈣鎂離子的溶液來稀釋樣品。
以上方式均需進行方法驗證，以證明對添加內毒素回收不存在抑制或增強，可以通過與水中對照內毒素的回收進行比較得以驗證。
5.3 建立BET 應注意的事項
5.3. 1 大輸液品種限值一般定為0.5Eu/ml., 小劑量注射劑及凍干劑限值按人臨床用每小時每公斤體重最大給藥劑量計算，同時應考慮聯合用藥及給藥途徑，推注、靜注應從嚴把握，必要時，對L值應作相應調整。單純的肌肉給藥且用量不大的品種可以不建立BET。
5.3.2 限值單位表述方法應正確、規范；注射用、凍干劑一般以主藥含量計算，以Eu/mg表示；不宜用Eu/每瓶表示。小劑量注射液用Eu/mg或Eu/ml均可；大劑量注射液一般用Eu/ml表示。
5.3. 3 所有稀釋用水均應為細菌內毒素檢查用水，因為注射用水和其它去離子水中內毒素及其它因素控制要求較低，會影響細菌內毒素的檢查。
5.3.4標準的制定應有依據，應有起草說明. 不僅僅新藥，仿制藥也應做方法學研究；因為不同的工藝生產的樣品往往質量不一樣；建議使用三批不同時間生產的樣品，用2個以上廠家生產的鱟試劑進行方法學研究、以考察制劑工藝的穩定性。